Oxidação anaeróbica de propano acoplada à redução de nitrato por uma linhagem da classe Symbiobacteriia

Nature Communications volume 13, número do artigo: 6115 (2022) Citar este artigo

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Acredita-se que os microrganismos anaeróbicos desempenhem um papel crítico na regulação do fluxo de alcanos gasosos de cadeia curta (SCGAs; incluindo etano, propano e butano) dos ecossistemas terrestres e aquáticos para a atmosfera. Foi confirmado que o sulfato atua como aceptor de elétrons apoiando a oxidação anaeróbica microbiana de SCGAs, embora vários outros aceitadores energeticamente mais favoráveis coexistam com esses gases em ambientes anaeróbicos. Aqui, mostramos que um biorreator semeado com biomassa de uma estação de tratamento de águas residuais pode realizar oxidação anaeróbica de propano acoplada à redução de nitrato em gás dinitrogênio e amônio. O biorreator funcionou por mais de 1000 dias e utilizamos experimentos de marcação 13C e 15N, análises metagenômicas, metatranscriptômicas, metaproteômicas e metabólicas para caracterizar a comunidade microbiana e os processos metabólicos. Os dados sugerem coletivamente que uma espécie que representa uma nova ordem dentro da classe bacteriana Symbiobacteriia é responsável pela oxidação de propano dependente de nitrato observada. O genoma fechado deste organismo, que designamos como 'Candidatus Alkanivorans nitratireducens', codifica vias para a oxidação do propano em CO através da adição de fumarato e para a redução do nitrato, com todos os genes-chave expressos durante a oxidação do propano dependente de nitrato. Nossos resultados sugerem que o nitrato é um sumidouro de elétrons relevante para a oxidação do SCGA em ambientes anaeróbicos, constituindo uma nova ligação mediada microbianamente entre os ciclos do carbono e do nitrogênio.

Uma quantidade considerável de gás natural é gerada a partir de sedimentos de águas profundas e infiltrações de hidrocarbonetos nas margens continentais e nos ecossistemas terrestres1,2. A maior parte do gás natural liberado é consumido por microrganismos em zonas anóxicas antes que o gás se difunda em ambientes óxicos e na atmosfera3,4,5. Os estudos de oxidação anaeróbica do gás natural concentraram-se no potente gás de efeito estufa, o metano, como o componente mais abundante (~60-90%)6,7. No entanto, os alcanos gasosos de cadeia curta (SCGAs), incluindo etano, propano, n-butano e isobutano, também são constituintes substanciais do gás natural (até ~20%)8 e são importantes precursores do ozônio e dos aerossóis orgânicos9. As emissões atmosféricas globais de SCGAs são estimadas em 9,2-9,6 Tg ano-1 para etano, 9,6-10,5 Tg ano-1 para propano, 10 Tg ano-1 para butano e 4,2 Tg ano-1 para iso-butano10.

A oxidação anaeróbica do metano (OMA) tem sido extensivamente estudada e é relativamente bem compreendida7,11,12,13,14,15,16,17. Archaea metanotrófica anaeróbica (ANME) oxida o metano através da via de metanogênese reversa, incluindo o complexo chave metil-CoM redutase (MCR). O ANME transporta elétrons do metano para bactérias sintróficas redutoras de sulfato (SRB) ou diretamente para a redução de nitrato e óxidos metálicos . A bactéria 'Candidatus Methylomirabilis oxyfera' realiza OMA através da via de oxidação “intra-aeróbica” do metano usando nitrito como único aceptor de elétrons . Os microrganismos provavelmente também acoplam a oxidação dos SCGAs à redução desses aceitadores de elétrons sob condições anóxicas . 'Cá. M. oxyfera' mostrou-se capaz de oxidar etano e propano através da metano monooxigenase, embora ainda não tenha sido demonstrado se essas fontes de carbono suportam o crescimento . Até o momento, o sulfato tem sido o único sumidouro de elétrons identificado para apoiar a oxidação anaeróbica dos SCGAs . O isolado deltaproteobacteriano Desulfosarcina aeriophaga BuS5 oxida propano e butano através da via de adição de fumarato gerando succinatos alquil-substituídos, um processo mediado pela alquilsuccinato sintase (ASS) , e reduz diretamente o sulfato a sulfeto. Descobriu-se que um enriquecimento do archaeon 'Candidatus Syntrophoarchaeum' ativa o butano através da formação de butil-coenzima M, um processo catalisado por um MCR divergente, com equivalentes redutores canalizados para parceiros SRB sintróficos . Da mesma forma, a oxidação anaeróbica do etano foi associada ao 'Candidatus Argoarchaeum ethanivorans' relacionado, que também codificava um complexo semelhante ao MCR e foi sugerido que formava uma relação sintrófica com o SRB22. No entanto, um archaeon capaz de mediar a oxidação anaeróbica do propano diretamente acoplada à redução do sulfato ainda não foi identificado.

90% and >70% bootstrap values, respectively. The scale bars indicate amino acid substitutions per site. b A composite fluorescence micrograph of the enrichment culture hybridized with the SYMB-1018 FISH probe (Cy3, red; targeting ‘Ca. A. nitratireducens’) and stained with DAPI (blue; all microbial cells). ‘Ca. A. nitratireducens’ cells appear magenta (blue + red). The scale bar indicates 20 μm. The representative image was selected based on the visual assessment of six separate hybridisation experiments. Consistent results were also obtained independently with two additional probes targeting the ‘Ca. A. nitratireducens’ population (Supplementary Fig. 8). c, d Relative expression of each genome and unbinned contigs, and microbial metabolism of interest for the genomes in the bioreactor. The total transcripts per million (TPM) was calculated for each gene. Genome sets with overall expression of total TPM > 1% are shown (c). KEGG annotation was used to identify ORFs coding for denitrification (M00529) and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (M00530) pathways (d). Source data are provided as a Source Data file./p> 147.2) of the enriched culture extracts (n = 3, taken at various time points) revealed a peak at retention time 10.832 min, matching the peak of the iso-propylsuccinate standard. b A peak at retention time 11.078 min (ion transition, m/z: 289 > 147.1), corresponding to the peak from the propylsuccinate standard, was observed for cell extracts from the enriched culture (n = 3 at different sampling points). c Phylogenetic relationship of ‘Ca. A. nitratireducens’ AssA (Red) to other AssA and BssA in the NCBI database. Three AssA subunits (AssA123) found in ‘Ca. A. nitratireducens’ MAG formed a separate cluster. Bootstrap values >90% are shown as black dots on branch nodes. Scale bar represents amino acid substitutions per site./p> 147.2) and propylsuccinate (m/z: 289 > 147.1) standards were detected in the cell extracts (Fig. 4a, b). These findings support the hypothesis that ‘Ca. A. nitratireducens’ activates propane through homolytic C-H bond cleavage at both primary and secondary carbon atoms, and with addition of fumarate, yields propylsuccinate and iso-propylsuccinate. In addition, iso-propylsuccinate (5.96 nM) was more abundant than propylsuccinate (2.33 nM) in the culture extracts, suggesting the secondary carbon atom activation generating iso-propylsuccinate is the main route of propane oxidation (Fig. 5)./p> Q5. Among them, 12 million reads were longer than 1000 bp with read N50 of 6,135 bp. Adapters were trimmed using Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop)./p> 30 was selected and mapped to the KEGG Orthology database. The eggNOG v5 database was searched against using emapper 2.1.5 in diamond mode. Conserved motif(s) present within the predicted genes related to propane oxidation and nitrogen metabolism were further verified using NCBI’s conserved domain search62. Annotated KO numbers were used for inferring the pathway encoded in each genome. Pathways were identified as ‘not expressed’ if missed blocks > 75% when total blocks > 5, or missed blocks > 1 when total blocks ≤ 5./p>92% similarity), the probes were designed against the 16 S sequence of ‘Ca. A. nitratireducens’ and care should be taken in their application beyond well characterised systems. Given there are no cultured representatives available for probe validation, three FISH probes were designed to target different sites on the ‘Ca. A. nitratireducens’ 16 S rRNA to give higher confidence in their specificity. These included the SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) and SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ) probes. Unlabelled helper probes78 were designed to target the flanking regions of each probe site to increase accessibility to the target site for optimal fluorescent signal (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Helper probes were applied in equimolar amounts with their respective probe. The 5ʹ and 3ʹ ends of the oligonucleotide FISH probes were labelled with the Cy3 fluorophore and were synthesized by Integrated DNA Technologies, Singapore. A higher signal was achieved for these FISH probes with lysozyme pre-treatment of the biomass (0.5 mg ml−1 in 0.05 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH 8) for 30 min at room temperature. The Non-EUB nonsense probe was used as a negative hybridization control79. DAPI (1 ng/µl) staining of cells was performed for 15 min in the dark. The labelled biomass was visualized with a Stellaris5 white light laser confocal microscope (Leica, Germany)./p>