O excesso de formato impulsiona o aprisionamento de folato tóxico em células cancerígenas inibidas por MTHFD1

Nature Metabolism volume 5, páginas 642–659 (2023)Cite este artigo

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As células cancerígenas alimentam a sua maior necessidade de fornecimento de nucleótidos, regulando positivamente o metabolismo de um carbono (1C), incluindo as enzimas metilenotetrahidrofolato desidrogenase-ciclohidrolase 1 e 2 (MTHFD1 e MTHFD2). TH9619 é um potente inibidor das atividades de desidrogenase e ciclohidrolase em MTHFD1 e MTHFD2 e mata seletivamente as células cancerígenas. Aqui, revelamos que, nas células, o TH9619 tem como alvo o MTHFD2 nuclear, mas não inibe o MTHFD2 mitocondrial. Assim, o excesso de formato das mitocôndrias continua na presença de TH9619. TH9619 inibe a atividade de MTHFD1 que ocorre a jusante da liberação de formato mitocondrial, levando ao acúmulo de 10-formil-tetrahidrofolato, que chamamos de 'armadilha de folato'. Isto resulta na depleção de timidilato e na morte de células cancerígenas que expressam MTHFD2. Este mecanismo de captura de folato, anteriormente não caracterizado, é exacerbado pelos níveis fisiológicos de hipoxantina que bloqueiam a via de novo da síntese de purinas e, adicionalmente, evitam o consumo de 10-formil-tetrahidrofolato para a síntese de purinas. O mecanismo de captura de folato descrito aqui para TH9619 difere de outros inibidores e antifolatos de MTHFD1/2. Assim, nossas descobertas revelam uma abordagem para atacar o câncer e revelam um mecanismo regulador no metabolismo 1C.

O metabolismo de um carbono (1C) é fundamental para o fornecimento de nucleotídeos para a síntese e reparo do DNA. Sem fornecimento suficiente de nucleotídeos para atender às demandas proliferativas, as células sofrem interrupção do ciclo celular ou morte celular devido ao estresse de replicação e instabilidade genômica . As enzimas envolvidas na via do metabolismo 1C são comumente reguladas positivamente no câncer para produzir nucleotídeos e aminoácidos necessários para a rápida proliferação .

O metabolismo 1C é predominantemente alimentado pelo aminoácido não essencial serina, que pode ser gerado a partir do intermediário glicolítico 3-fosfoglicerato ou fornecido pelo espaço extracelular7. O catabolismo da serina através do metabolismo 1C dependente de folato é necessário para a síntese de nucleotídeos. É mediado por quatro reações enzimáticas reversíveis que ocorrem nas mitocôndrias e no citosol (Fig. 1a). A serina hidroximetil transferase (SHMT) transfere um grupo hidroximetil da serina para o tetrahidrofolato (THF) para gerar 5,10-metilenotetrahidrofolato (CH2-THF) e glicina. A metilenotetrahidrofolato desidrogenase-ciclohidrolase (MTHFD) oxida e hidrolisa o CH2-THF em 10-formil-tetrahidrofolato (10-CHO-THF), que é então hidrolisado em THF e formato pela formil THF sintetase. No citosol, essas reações são catalisadas por SHMT1 e pelo MTHFD1 trifuncional, que compreende dois domínios distintos, o domínio desidrogenase-ciclohidrolase (DC) e o domínio formil THF sintetase (FS). Na mitocôndria, as mesmas reações são catalisadas por SHMT2, MTHFD2 bifuncional (atividade DC) e MTHFD1L (atividade FS) (Fig. 1a)8. Embora existam variações9, a direcionalidade canônica da via segue o catabolismo da serina e a oxidação da unidade 1C através da mitocôndria, enquanto as unidades 1C citosólicas seguem uma rota redutora (reversa) que é impulsionada por uma alta relação NADPH: NADP + citosólica . Dessa forma, o metabolismo 1C forma um ciclo que se espalha entre a mitocôndria e o citoplasma. Devido à reversibilidade das reações catalisadas por SHMT1 e MTHFD1, a perda do metabolismo 1C mitocondrial pode ser compensada pela via citosólica .

a, fluxo metabólico 1C entre mitocôndrias e citosol/núcleo. b – e, curvas dose-resposta de células SW620 tratadas por 96 h com TH9619 (b), TH9975 (c), DS18561882 (d) ou SHIN1 (e) na presença de 50 μM de timidina, 1 mM de formato de sódio ou veículo ( cultivado em RPMI-FBS), média ± dp (n = 3). f, taxa de liberação de formato derivado de serina [U-13C] de células SW620 WT, MTHFD2-/- e SHMT1-/- tratadas por 24 h com as concentrações indicadas de TH9619 e TH9975 ou 50 nM MTX (cultivadas em RPMI-FBS) , significa ± dp (n = 3 para controle e TH9619, n = 2 para TH9975, n = 1 para MTX); ANOVA unidirecional (análise de variância) com teste de comparações múltiplas de Tukey. g, Quantificação do potencial de membrana mitocondrial em células SW620 WT tratadas com 1 µM de TH9619 ou TH9975 ou 0,5 µM de MTX por 48 h. FCCP foi utilizado como controle positivo. Os dados são exibidos como médias ± dp (n = 4, n = 5 para FCCP); ANOVA unidirecional com teste de Dunnett para comparações múltiplas. h, i, análise CETSA da estabilização de MTHFD2 em células SW620 WT tratadas durante 3 h com 10 µM de TH9619 ou veículo. A estabilização do MTHFD2 foi avaliada por western blot normalizando o sinal restante do MTHFD2 para HSP60 nas frações mitocondriais (h) ou lamina A/C nas frações nucleares (i). j, Immunoblots representativos de um de dois experimentos independentes. k, análise DARTS da estabilização de MTHFD1 em lisados ​​SW620 que foram incubados com 10 µM de TH9619 ou veículo durante 30 min, seguido de digestão de proteínas com aumento da concentração de pronase e avaliação da degradação de MTHFD1 por western blot. O sinal MTHFD1 foi normalizado para SOD1. É mostrado um representante de três experimentos independentes. l, Valores médios de pIC50 (-log da metade da concentração inibitória máxima) para inibidores MTHFD1/2 indicados avaliados quanto à sua atividade inibitória contra MTHFD1(DC) WT ou mutante MTHFD1(DC) (Q100A), média (da esquerda para a direita n = 4, 9, 2, 19, 5, 15, 5, 6, 4, 8); teste t não pareado, bicaudal. m, o cassete CRISPR-Select para MTHFD1-Q100A foi entregue às células SW620. O gráfico mostra a proporção de MTHFD1-Q100A versus WT no dia 2 e no dia 25 do tratamento 10 μM TH9619 normalizado para o valor do dia 2, médias ± dp (n = 4); teste t pareado e bicaudal.